败血症是一种具有挑战性的临床综合征，由宿主对感染的反应失调引起。在这里，我们在单核细胞和巨噬细胞中发现了一种意想不到的乌头类脱羧酶1（ACOD1）的前体活性。以前的研究表明，ACOD1，也被称为免疫反应基因1，是一个免疫代谢调节器，有利于乌头酸盐的产生，以抑制细菌脂多糖诱导的先天免疫。我们使用脂多糖激活的THP1细胞的下一代测序，证明ACOD1的积累通过激活细胞因子风暴，主要是通过肿瘤坏死因子信号通路，赋予强大的促炎症反应。我们进一步发现，细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）在苏氨酸-160上的磷酸化通过活化C激酶1受体介导了有丝分裂原激活的蛋白激酶8的激活，导致人类和小鼠巨噬细胞或单核细胞中JUN依赖性的ACOD1转录。髓系细胞中CDK2或ACOD1的基因缺失，或给予CDK抑制剂dinaciclib，可保护小鼠免受多菌性败血症的影响，并与改善生存和减少细胞因子风暴有关。在一个由40名细菌性败血症患者组成的队列中，CDK2-ACOD1轴的表达也与疾病的严重程度相关。因此，我们的研究结果为ACOD1在先天性免疫中的功能提供了以前没有认识到的证据，并表明它是治疗败血症的一个潜在治疗目标。
1. CDK inhibitors block ACOD1 expression
虽然ACOD1的基础表达非常低，但在小鼠巨噬细胞系中，它被LPS处理（5μg/ml）高度诱导1。作者首先用Western blots检测了LPS处理后ACOD1在THP1中表达的时间和剂量反应曲线。用5 μg/ml的LPS处理6小时后，THP1细胞中的诱导性ACOD1表达达到顶峰，尽管100 ng/ml的LPS也强烈诱导ACOD1上调 (fig. S1, A and B)。LPS是通过细胞膜上的Toll样受体4（TLR4）或细胞质中的caspase 11（CASP11）被细胞识别。在培养的野生型（WT）和Casp11 -/-初级小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）中，LPS强烈上调Acod1 mRNA，但在Tlr4 -/-小鼠的PMs中则没有(fig. S1C)。此外，通过电穿孔将LPS直接送到细胞膜上，也不能诱导PMs中Acod1 mRNA的表达 (fig. S1C)。因此，LPS诱导的ACOD1的上调需要TLR4介导的信号转导。
Fig 1A： 蛋白激酶是TLR4介导的信号转导的重要组成部分。为了确定负责LPS诱导ACOD1表达的关键激酶，作者使用美国食品和药物管理局（FDA）批准的429种蛋白激酶抑制剂库，进行了四轮剂量依赖的药物筛选。
Fig 1B： 第一轮筛选显示，92个10μM的化合物，包括14个CDK抑制剂（占所有化合物的15.22%），完全阻断了LPS诱导的ACOD1在THP1细胞的表达。第二轮和第三轮分别以1μM和100nM的剂量进行筛选，进一步证实CDK抑制剂是作者筛选试验中LPS诱导的ACOD1蛋白表达的最有力的抑制剂。
Fig 1C： 在这些抑制剂中，10nM的dinaciclib也有效地阻断了LPS诱导的ACOD1蛋白在人类单核细胞（THP1细胞）和小鼠PMs、BMDMs和RAW264.7的上调。
Fig 1D： 一致的是，dinaciclib限制了LPS诱导的ACOD1 mRNA上调。
2. CDK2 phosphorylation on Thr160 drives ACOD1 expression
哺乳动物细胞含有九个CDK成员，CDK抑制剂通常针对不止一个CDK。例如，dinaciclib可抑制CDK1、CDK2、CDK5和CDK9。
Fig 1E：为了确定哪个CDK成员是LPS诱导的ACOD1上调的关键启动器，作者分析了14种CDK抑制剂（SNS-032、flavopiridol、PHA-793887, AT7519, BS-181, AZD5438, flavopiridol, R547, dinaciclib, abemaciclib, LDC000067, SU9516, purvalanol A, and P276-00）在第一轮筛选中完全阻断ACOD1表达。其中，有10种和8种CDK抑制剂被报道分别抑制了CDK2和CDK1。因此，作者在研究中重点关注CDK2和CDK1在调控ACOD1表达中可能发挥的作用。
Fig 1F-H： 作者使用基于慢病毒的短发夹RNA（shRNA）生成CDK1-或CDK2-封锁的THP1细胞。沉默CDK2，而不是CDK1，阻止了LPS诱导的ACOD1蛋白和mRNA在THP1细胞中的表达。
此外，LPS诱导的ACOD1表达的上调在髓系细胞中Cdk2条件性敲除的小鼠（LysM-Cre;Cdk2 flox/flox小鼠，称为Cdk2 Mye/-小鼠）中受到抑制。抑制CDK2未能诱导LPS处理的THP1细胞的细胞周期停止。将细胞暴露在dinaciclib下6小时，可抑制ACOD1的上调，但对细胞周期没有影响。因此，CDK2的经典细胞周期调控功能与LPS对ACOD1的上调无关。
Fig 1I： 作者进一步观察到，LPS迅速诱导CDK2在Thr 160上磷酸化，这是CDK2激酶激活的一个重要残基。
Fig 1J, K： 为了评估CDK2在Thr 160上的磷酸化对诱导ACOD1表达的重要性，作者比较了WT和Thr 160突变体（T160A）CDK2在CDK2停用的细胞中恢复LPS诱导的ACOD1表达的能力。与WT CDK2 cDNA相比，转导T160A突变体的cDNA未能挽救LPS诱导的ACOD1在CDK2停用细胞中的蛋白表达。因此，CDK2 Thr160对于LPS诱导的ACOD1蛋白表达是必不可少的。
3. CDK2 activates the JUN-dependent ACOD1 expression
以前的一项研究表明，NF-kB途径的激活有助于LPS诱导的ACOD1的表达。为了排除CDK2介导的ACOD1蛋白表达是否需要NF-kB途径，作者测量了p65的磷酸化，这是NF-kB激活的一个主要信号转导事件。用dinaciclib对CDK2的药理抑制或基因耗竭同样未能抑制LPS诱导的p65磷酸化，表明NF-kB不负责LPS诱导的ACOD1蛋白表达 (fig. S4A, B)。
Fig 2A： 为了确定CDK2介导的ACOD1上调的关键下游效应器，作者使用了proteome profiler antibody array来评估CDK2清除对45个应激相关蛋白的磷酸化的影响。这一筛选显示，LPS诱导的JUN（p-JUN）在Ser 63的磷酸化依赖于CDK2。
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Fig 2B： LPS诱导的p-JUN在3小时后在THP1、RAW264.7和BMDM细胞中上调，这伴随着JUN蛋白总量的增加。尽管p-JUN可以调节其自身的转录和随后的蛋白表达，但在CDK2敲除的细胞中，LPS诱导的这一过程减弱了，表明CDK2是LPS诱导的JUN上调和磷酸化的必要条件。
Fig 2C, D： 在 time course analysis 中，发现通过shRNA敲除JUN也减弱了LPS诱导的ACOD1 mRNA和蛋白的表达，而CDK2的丰度没有改变 (fig. S6C)。然后将JUN-cDNA或带有FLAG表位标签的CDK2-cDNA在JUN停用的THP1细胞中过量表达。JUN的过表达 (C)，而不是CDK2的过表达 (D)，抑制了LPS诱导的ACOD1在JUN sh的细胞中的上调。因此，JUN在驱动LPS诱导的ACOD1表达中作为CDK2的下游效应器。
由于JUN是LPS信号传导的转录因子之一，作者探讨了JUN是否通过其转录因子活性来调节LPS诱导的ACOD1上调。细胞分馏和免疫荧光实验表明，LPS诱导p-JUN在细胞核中的Ser 63处上调和积累，这是JUN作为转录因子被激活的一个关键步骤 (fig. S7, A and B)。LPS诱导p-JUN的时间最早为1小时 (fig. S7C)，这比LPS诱导的ACOD1 mRNA表达要早，首次观察到是在3小时 (fig. S7D)。对编码ACOD1的基因启动子序列的生物信息学分析确定了17个putative JUN binding motifs (table S1)。
Fig 2E： 因此，作者设计了五对引物，这些引物端对端重叠，覆盖了所有推定的结合位点，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）分析来检测JUN与ACOD1启动子的结合情况。
Fig 2F： 与其他预测区域相比，ACOD1启动子上-219和-86碱基对（bp）之间的一个区域，包含得分最高的JUN反应元件（-213至-207 bp），在LPS刺激后1小时高度富集。
Fig 2G： 为了研究JUN反应元件（-213至-207 bp）对ACOD1启动子活性的影响，我们将含有ACOD1启动子1000bp片段或含有突变体JUN结合区的ACOD1启动子片段的荧光素酶报告构建体与JUN蛋白表达质粒一起转染293FT胚肾细胞。在有JUN质粒的情况下，观察到WT启动子报告者的荧光素酶活性增加。相反，JUN反应元件的突变导致ACOD1启动子报告者的荧光素酶活性下降，进一步支持JUN反应元件负责ACOD1启动子的活性。
常规的找到目的蛋白的转录因子，Chip+荧光报告基因验证。
4. CDK2-mediated JUN activation relies on a direct interaction with receptor for activated C kinase 1 and mitogen-activated protein kinase 8
Fig 3A： 虽然CDK2和JUN都在核区被发现，但IP分析没有显示CDK2在LPS刺激的细胞的核成分中与JUN结合。另外，CDK2也可以定位在细胞质或细胞膜上，在那里它可能通过其他信号途径促进JUN的激活。为了测试这种可能性，作者用IP结合定量质谱法（IP-MS，参考：免疫沉淀-质谱联用(IP-MS)抗体验证）来确定THP1细胞在没有或有LPS处理时的CDK2结合蛋白。所有组别[未处理组、LPS组和非特异性结合的免疫球蛋白G（IgG）组]共鉴定了820个蛋白，发现34个未与对照IgG结合的候选蛋白在LPS暴露后与CDK2相互作用。随后对肽谱匹配度（PSM）和覆盖率较高的候选蛋白进行分析，发现活化C激酶1受体（RACK1）是特定CDK2结合蛋白的首要候选蛋白。
Fig 3B, C： CDK2和RACK1之间的相互作用被Co-IP分析所证实，这种相互作用被CDK2的sh所消除。
Fig 3D： 在用LPS或dinaciclib处理期间，CDK2和RACK1之间的相互作用没有改变，这表明LPS和dinaciclib对CDK2 RACK1复合物的影响是功能性的。
Fig 3F, G, H： 通过shRNA敲除RACK1，减少了LPS诱导的p-JUN和ACOD1在THP1细胞的丰度。由于LPS后JUN的丰度不一，RACK1和JUN之间的相互作用很难在THP1细胞中表现出来（图3C），表明RACK1可能不直接调节p-JUN。因为RACK1已被证明可以招募丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）来激活p-JUN以促进肿瘤生长，作者假设CDK2通过形成RACK1-MAPK8复合物来激活JUN。LPS刺激增加了RACK1和MAPK8之间的相互作用，这一过程被dinaciclib减少（图3，D和E）。敲除CDK2和RACK1也同样减少了LPS诱导的MAPK8磷酸化（图3，G和H）。
Fig 3I： 小分子化合物BI-78D3对MAPK8的抑制也削弱了LPS诱导的MAPK8磷酸化、p-JUN和ACOD1在THP1和BMDMs的上调。
Fig 3J： LPS诱导的MAPK8和JUN之间的相互作用被BI-78D3所阻断。
Fig 3K： 此外，T160A突变体CDK2抑制了LPS引起的MAPK8的磷酸化。
5. The CDK2-JUN-ACOD1 axis mediates TNF pathway activation
Fig 4A, B： 接下来，作者进行了RNA测序，以确定LPS激活的WT、CDK2敲除（CDK2KD）和JUN敲除（JUNKD）的THP1细胞之间的转录组差异。差异表达基因的通路富集分析显示，TNF信号通路是受LPS影响最大的免疫信号通路 (A)，这与LPS是细菌感染期间TNF激活的强刺激因素的观点一致。然而，LPS对TNF信号通路的激活在CDK2KD和JUNKD细胞中受到限制（A, B）。核苷酸寡聚结构域（NOD）样受体蛋白家族是一组模式识别受体，已知介导对感染和损伤的初始先天免疫反应，是另一个被CDK2或JUN缺失抑制的途径（A）。
Fig 4C, D： 此外，基因集富集分析（GSEA）显示，LPS诱导的炎症反应（C）和细胞因子的产生（D）在CDK2KD和JUNKD细胞中被减弱，支持CDK2和JUN在介导LPS信号中的普遍促炎作用。
Fig 4E, F： 除了前50个CDK2/JUN依赖的LPS上调的基因是促炎症介质。热图分析进一步显示，LPS诱导的TNF信号通路中的29个上调基因在CDK2KD中被LPS inKD WT抑制，但在CDK2KD和JUNKD THP1细胞中没有抑制，支持LPS诱导的ACOD1的上调是CDK2和JUN依赖的结论。
Fig 5A： 为了阐明ACOD1上调和TNF信号通路的基因表达增加之间的关系，作者使用聚类定期间隔短回文重复（CRISPR）和CRISPR相关蛋白9技术来创建ACOD1-/-THP1细胞。
Fig 5B： qPCR分析表明，在WT细胞中由LPS上调的TNF信号通路的82%的基因，在ACOD1 -/-细胞中未能增加，表明LPS诱导的ACOD1上调对维持TNF信号通路很重要。
Fig 5C, D： 因为TNF本身也能诱导巨噬细胞中ACOD1的上调2，作者研究了TNF对LPS诱导的ACOD1丰度在CDK2 KD和JUNKD THP1细胞中的影响。LPS诱导的TNF mRNA和TNF释放在CDK2 KD和JUNKD细胞中被削弱。
Fig 5E：然而，外源性TNF在WT细胞中增强了LPS诱导的ACOD1 mRNA表达，但在CDK2 KD和JUN KD细胞中没有增强。CDK2和JUN的缺失也限制了干扰素-γ诱导的ACOD1 mRNA的上调，无论是否有LPS处理，在THP1细胞中都是如此。3′，3′-环鸟苷5′-单磷酸-腺苷3′，5′-单磷酸（3′3′-cGAMP。刺激IFN基因的激动剂），5′ppp-双链RNA（dsRNA）（维甲酸诱导基因I激动剂），或ODN2006（TLR9激动剂）未能诱导THP1细胞中ACOD1的表达。热杀李斯特菌（HKLM；TLR2激动剂）诱导的ACOD1表达在CDK2和JUN KD THP1细胞中被抑制。
Fig 5F：在CDK2 KD和JUN KD THP1细胞中，大肠杆菌或肺炎链球菌感染引起的ACOD1 mRNA上调也受到抑制。因此，CDK2和JUN在介导ACOD1在各种炎症刺激下的上调中发挥了广泛的作用。
Fig 5G：接下来，作者研究了ACOD1介导的TNF通路基因的上调是否取决于衣康酸的产生。首先，作者确认在CDK2KD、JUN KD或ACOD1 -/- THP1细胞中，LPS诱导的衣康酸生成被阻断。其次，作者观察到，在LPS处理过的ACOD1-/-THP1细胞中，4-辛酯（4-OI）--一种可渗透到细胞中去的衣康酸盐，只能挽救C-X-C动因趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL2和CXCL3的mRNA表达（图5B）。然而，在LPS处理的ACOD1 THP1细胞中，66%测量的TNF信号通路基因（包括TNF）没有被衣康酸恢复（图5，B和H）。第三，酶联免疫吸附试验或qPCR分析显示，敲入ACOD1（而不是使用4-OI）可以恢复LPS诱导的TNF释放（图5I）和TNF mRNA（图5J）在CDK2 KD , JUNKD , 和ACOD1 -/-细胞中。因此，在ACOD1-/-细胞中，大多数与TNF信号相关的基因（包括TNF本身）都以不依赖衣康酸的方式受到抑制。
柠檬酸合成酶（CS）介导的柠檬酸盐生产被克雷布斯循环酶乌头酸酯2（ACO2）转换为顺式乌头酸酯。然后ACOD1通过顺式乌头酸盐的脱羧作用产生衣康酸。与敲除ACOD1类似，通过shRNAs敲除CS或ACO2（图5K）可抑制LPS诱导的乌头酸盐的产生（图5L），但不能抑制TNF的产生（图5M）。这些发现表明，ACOD1介导的TNF产生可能与它在中心碳代谢中的酶功能无关。相反，在对编码已知的ACOD1结合蛋白[谷氨酸-氧乙酸转氨酶2、鸟苷三磷酸酶IMAP家族成员7（GIMAP7）、羧肽酶A6、儿茶酚-O-甲基转移酶、细胞色素P450家族26亚家族A成员1]的基因进行小RNA干扰筛选后。含有12A的锌指CCCH型，含有66的富含亮氨酸的重复，含有四肽重复的干扰素诱导蛋白1，芳基硫酸酯酶家族成员I和溶菌酶G2]基于STRING蛋白质-蛋白质相互作用数据库，作者证明GIMAP7是LPS诱导的TNF产生所必需的（图5，M和N）。然而，GIMAP7对LPS诱导的衣康酸的产生并不重要（图5L）。正如所料，LPS增加了GIMAP7和ACOD1在THP1细胞中的结合和共定位（图5，O和P）。已知ACOD1与RAB32相互作用，以促进线粒体到吞噬体的运输。与GIMAP7的敲除不同（图5M），RAB32的敲除未能影响LPS诱导的THP1细胞的TNF生产（图5，Q和R）。这些发现表明，ACOD1可能形成不同的蛋白复合物，分别调控衣康酸运输和TNF产生。
由于CXCL1、CXCL2和CXCL3是与一个共同的受体CXCR2结合的趋化因子，作者确定ACOD1介导的衣康酸生成是否对CXCR2相关的趋化因子有特殊要求。RNA测序数据显示，CXCL9（CXCR3的配体）、CXCL10（CXCR3的配体）和CXCL11（CXCR3的配体）是被LPS诱导的前20个上调基因，并受CDK2和JUN的调节（图4，E和F）。敲除ACOD1或用4-OI处理可恢复LPS诱导的CXCR2配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8）在CDK2 KD、JUNKD或ACOD1 -/- THP1细胞的表达（图5J）。然而，只有敲除ACOD1（不用4-OI处理）才能恢复LPS诱导的CXCR3配体（CXCL9、CXCL10和CXCL11）在CDK2、JUN KD或ACOD1 -/- THP1细胞中的表达（图5J）。因此，在CDK2-JUNACOD1轴介导的CXCR2配体生产中，衣康酸是必需的，而在活化的THP1细胞中，衣康酸对CXCR3配体的生产是不可缺少的。
6. Depletion of CDK2 or ACOD1 in myeloid cells protects mice against lethal polymicrobial sepsis
粪便结扎和穿孔（CLP）模型是一种公认的败血症研究模型。WT、Cdk2 -/-或Acod1 -/-小鼠用27号针头（诱发轻度败血症）、22号针头（中度败血症）、17号针头（重度败血症）的注射器针头做CLP处理。与WT小鼠相比，Cdk2 -/-或Acod1 -/-小鼠在CLP诱导的败血症中的存活率增加，表明CDK2和ACOD1的激活有助于小鼠败血症的死亡。分析与败血症有关的细胞因子[TNF和IL-6]、趋化因子（CXCL9和CXCL10）、HMGB1和SQSTM1的血浆浓度。在重度败血症模型中，组织功能障碍标志物ALT和BUN和血凝标志物（D-二聚体）进一步证实了CDK2和ACOD1在促进系统性炎症和组织损伤中的作用。正如预期的那样，在Cdk2 -/或Acod1 -/-小鼠中，CLP诱导的Acod1 mRNA表达的上调和PMs中的衣康酸浓度被削弱了。
虽然ACOD1主要在骨髓细胞（包括单核细胞和巨噬细胞）中表达，但它也可以在非免疫细胞中表达，如肝细胞，以调节炎症。为了进一步确定骨髓细胞中的CDK2-ACOD1途径在败血症的发展中起主要作用，作者使用了Cdk2 Mye-/-和Acod1 Mye-/-小鼠，它们有条件地耗尽了骨髓细胞中的Cdk2或Acod1。与Cdk2 -/-或Acod1 -/小鼠相似，Cdk2 Mye-/-和Acod1 Mye-/-小鼠在CLP诱导的高等级败血症后显示出更高的生存率（图6A），减少了系统性炎症（图6，B至G），限制了肝肾功能障碍（图6，H和I），并降低了凝血二聚体浓度（图6J）。这些对败血症的保护作用在骨髓细胞中Cdk2和Acod1双重条件性敲除的小鼠中得到进一步加强（图6，A至J）。衣康酸通过抑制异柠檬酸酯酶而具有已知的抗菌活性。在Acod1 Mye-/-小鼠中，CLP后24小时，血液中的菌落形成单位（CFU）数量增加（图6K）。然而，这一趋势在48小时后被逆转（图6K），这表明ACOD1介导的衣康酸生产可能只有利于早期阶段的细菌清除。
Cdk2 Mye-/-和Acod1 Mye-/-小鼠也表现出对大肠杆菌感染的存活率增加（图6L）。相反，肝细胞中Cdk2或Acod1的条件性敲除（Cdk2 Hep-/-和Acod1 Hep-/-小鼠）对CLP引起的败血症死亡没有影响，无论是否有抗生素（亚胺培南和西司他丁）处理（图6，M和N）。
7. Dinaciclib protects mice from polymicrobial sepsis
与CDK2或ACOD1缺失的小鼠类似，与对照组相比，CLP后2小时开始给予dinaciclib可抑制死亡率，这与循环炎症细胞因子、趋化因子、DAMPs、组织功能障碍酶和D-二聚体的产生减少有关。Dinaciclib对抑制Acod1 mRNA表达和CLP诱导的衣康酸生成的效果在PMs中得到证实。在临床相关的败血症模型中，Dinaciclib阻断ACOD1的上调也能防止在CLP后2、24、48和72小时内给予抗生素（亚胺培南和西司他丁）的败血症死亡。此外，当小鼠腹腔感染大肠杆菌或肺炎双球菌（分别是人类因革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌感染而败血症死亡的主要原因）时，迪那克里布的给药可防止败血症死亡。最后，在CLP后的24、48和72小时内对小鼠反复腹腔注射dinaciclib，以剂量依赖的方式提高了动物的生存率。
作者根据Sepsis-3指南调查了CDK2-ACOD1途径是否在细菌性败血症患者的外周血单核细胞（PBMCs）中发生改变。40名细菌性败血症患者队列的患者人口学和临床特征在作者以前的研究中显示。非幸存者队列的顺序器官衰竭评估（SOFA）和弥散性血管内凝血（DIC）得分高于幸存者队列。与幸存者或非DIC组相比，非幸存者组或DIC组的PBMC样本表达的CDK2和ACOD1 mRNA更高（图7，A和B）。SOFA和DIC评分与CDK2（图7，C和D）或ACOD1（图7，E和F）的mRNA表达相关。CDK2和ACOD1的mRNA表达与循环免疫介质的浓度（TNF、IL-6和HMGB1）之间也有正相关（图7G）。
参考文献：
- T. Basler, S. Jeckstadt, P. Valentin-Weigand, R. Goethe, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis, and lipopolysaccharide induce different transcriptional and post-transcriptional regulation of the IRG1 gene in murine macrophages. J. Leukoc. Biol. 79, 628–638 (2006).
- D. Degrandi, R. Hoffmann, C. Beuter-Gunia, K. Pfeffer, The proinflammatory cytokine-induced IRG1 protein associates with mitochondria. J. Interferon Cytokine Res. 29, 55–67 (2009).